Desafíos/Rebirth

Los desafios son unas partidas unicas en el juego. Generalmente el jugador comienza con uno o mas objetos especificos que hacen el juego mas dificil. No se pueden encontrar Habitaciones del Tesoro (excepto en el primer y decimo desafio). Al completar uno de los veinte desafios desbloqueara nuevo contenido para el juego, como las Runas.

Lista de Desafios

Nombre	Condiciones	Mision	Desbloq. por	Desbloquea
1. Pitch Black	No puedes ver tu salud y las salas son oscuras. Las Hab. del Tesoro estan disponibles. Sin Tiendas.	Mom	Por defecto	Rune of Hagalaz
2. High Brow	Inicia con: Number One, E Coli, Butt Bombs, Flush! como objeto activable y Petrified Poop como Trinket.	Mom	Por defecto	Rune of Jera
3. Head Trauma	Inicia con: Tiny Planet, Soy Milk, Small Rock e Iron Bar.	Mom	Por defecto	Rune of Ehwaz
4. Darkness Falls	El desafio empieza con Eve. Inicia con: Pentagram, Dead Bird, Whore Of Babylon, Razor Blade, Sacrificial Dagger  y Dark Matter.	Satan	Desbloqueando a 'It Lives'.	Rune of Dagaz
5. The Tank	El desafio empieza con Magdalene. Inicia con: Lard, Infamy, Yum Heart y Thunder Thighs.	Mom	Desbloqueando a Magdalene	Rune of Ansuz
6. Solar System	Inicia con: Transcendence, Distant Admiration, Forever Alone, Halo of Flies. Empiezas como Lord of the Flies, vuelo y convirtiendo todas las moscas pequeñas en moscas azules las cuales ayudan a Isaac. No puedes usar lagrimas (Las moscas y los bebes son tu unico tipo de daño).	Mom's heart	Desbloqueando Trascendence	Rune of Perthro
7. Suicide King	El desafio empieza con Lazarus. Inicia con: Ipecac, Mr. Mega, My Reflection.	Isaac	Desbloqueando a 'It Lives'	Suicide King
8. Cat Got Your Tongue	Inicia con: Guppy's Head, Guppy's Tail, and Guppy's Hair Ball. Empiezas como Guppy, vuelo y crea moscas azules con ataques. Apareces vendado, y no puedes usar lagrimas. El daño debe ser hecho inicialmente con la bola de pelos.	Mom	Transformarse en Guppy	Rune of Algiz
9. Demo Man	Inicia con: Dr. Fetus, Remote Detonator, Match Stick como trinket.	Mom's Heart	Desbloqueando Dr. Fetus	Chaos Card
10. Cursed!	Empiezas como Magdalene. Inicia con: Yum Heart, Raw Liver, The Compass, Treasure Map, Blue Map y Child's Heart  como trinket. Entrar o salir de cualquier sala normal producira daño al personaje. Hab. del Tesoro disponibles.	Mom	Desbloqueando a Magdalene	Credit Card
11. Glass Cannon	Empiezas como Judas. Inicia con: Epic Fetus, Loki's Horns.	Satan	Desbloqueando Epic Fetus (Desafio 19) y Loki's Horns	Rules Card
12. When Life Gives You Lemons	Inicia con: Lemon Mishap, 9 Volt, Habit and 1 Lemon Party pill.	Mom	Por defecto	A Card Against Humanity
13. Beans!	Inicia con: Pyro, The Bean, The Black Bean, 9 Volt, Butt Bombs. No puedes usar lagrimas (Solo se puede dañar con bombas o usando The Bean).	Mom	Por defecto	Burnt Penny
14. It's in the Cards	Inicia con: Deck of cards, Starter deck, The Battery, 9 Volt, 2 cartas de Tarot aleatorias.	Mom	Por defecto	SMB Super Fan
15. Slow Roll	Inicia con: Polyphemus, My Reflection, Cupid's Arrow.	Mom	Por defecto	Swallowed Penny
16. Computer Savvy	Inicia con: Technology, Technology 2 y Spoon Bender.	Mom	Por defecto	Robo-Baby 2.0
17. Waka Waka	Inicia con: Strange Attractor y Anti-Gravity.	Mom	Por defecto	Death's Touch
18. The Host	Inicia con: Spider Baby, The Mulligan, y The Tick como trinket.	Mom	Por defecto	Technology .5
19. The Family Man	Inicia con:Brother Bobby, Sister Maggy, Dad's Key, BFFS! y Rotten Baby. No puedes usar lagrimas (Los familiares son la unica fuente de ataque)	Isaac	Desbloqueando  Dad's Key y a 'It Lives'	Epic Fetus
20. Purist	No item rooms or starting items.	Mom's Heart	Matar al corazon de mama por primera vez	Rune of Berkano

Afterbirth

                                     Inicia con Isaac sin items, algo      Mom's Heart        Matar al corazon 

21. XXXXXXXXL            Parecido a Purist solo que todos                               de mama por 

                                     los Mapas son XL                                                    primera vez          Corazon de oro