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Los desafios son unas partidas unicas en el juego. Generalmente el jugador comienza con uno o mas objetos especificos que hacen el juego mas dificil. No se pueden encontrar Habitaciones del Tesoro (excepto en el primer y decimo desafio). Al completar uno de los veinte desafios desbloqueara nuevo contenido para el juego, como las Runas.

Lista de DesafiosEditar

Nombre Condiciones Mision Desbloq. por Desbloquea
1. Pitch Black No puedes ver tu salud y las salas son oscuras.

Las Hab. del Tesoro estan disponibles. Sin Tiendas.

Mom Por defecto Rune of Hagalaz
2. High Brow Inicia con: Number One, E Coli, Butt Bombs, Flush! como objeto activable y Petrified Poop como Trinket. Mom Por defecto Rune of Jera
3. Head Trauma Inicia con: Tiny Planet, Soy Milk, Small Rock e Iron Bar. Mom Por defecto Rune of Ehwaz
4. Darkness Falls El desafio empieza con Eve. Inicia con: Pentagram, Dead Bird, Whore Of Babylon, Razor Blade, Sacrificial Dagger  y Dark Matter. Satan Desbloqueando a 'It Lives'. Rune of Dagaz
5. The Tank El desafio empieza con Magdalene. Inicia con: Lard, Infamy, Yum Heart y Thunder Thighs. Mom Desbloqueando a Magdalene Rune of Ansuz
6. Solar System Inicia con: Transcendence, Distant Admiration, Forever Alone, Halo of Flies.

Empiezas como Lord of the Flies, vuelo y convirtiendo todas las moscas pequeñas en moscas azules las cuales ayudan a Isaac.
No puedes usar lagrimas (Las moscas y los bebes son tu unico tipo de daño).

Mom's heart Desbloqueando Trascendence Rune of Perthro
7. Suicide King El desafio empieza con Lazarus. Inicia con: Ipecac, Mr. Mega, My Reflection. Isaac Desbloqueando a 'It Lives' Suicide King
8. Cat Got Your Tongue Inicia con: Guppy's Head, Guppy's Tail, and Guppy's Hair Ball.

Empiezas como Guppy, vuelo y crea moscas azules con ataques.
Apareces vendado, y no puedes usar lagrimas. El daño debe ser hecho inicialmente con la bola de pelos.

Mom Transformarse en Guppy Rune of Algiz
9. Demo Man Inicia con: Dr. Fetus, Remote Detonator, Match Stick como trinket. Mom's Heart

Desbloqueando Dr. Fetus

Chaos Card
10. Cursed! Empiezas como Magdalene. Inicia con: Yum Heart, Raw Liver, The Compass, Treasure Map, Blue Map y Child's Heart  como trinket.

Entrar o salir de cualquier sala normal producira daño al personaje.
Hab. del Tesoro disponibles.

Mom Desbloqueando a Magdalene Credit Card
11. Glass Cannon Empiezas como Judas. Inicia con: Epic Fetus, Loki's Horns. Satan Desbloqueando Epic Fetus (Desafio 19) y Loki's Horns Rules Card
12. When Life Gives You Lemons Inicia con: Lemon Mishap, 9 Volt, Habit and 1 Lemon Party pill. Mom Por defecto A Card Against Humanity
13. Beans! Inicia con: Pyro, The Bean, The Black Bean, 9 Volt, Butt Bombs.

No puedes usar lagrimas (Solo se puede dañar con bombas o usando The Bean).

Mom Por defecto Burnt Penny
14. It's in the Cards Inicia con: Deck of cards, Starter deck, The Battery, 9 Volt, 2 cartas de Tarot aleatorias. Mom Por defecto SMB Super Fan
15. Slow Roll Inicia con: Polyphemus, My Reflection, Cupid's Arrow. Mom Por defecto Swallowed Penny
16. Computer Savvy Inicia con: Technology, Technology 2 y Spoon Bender. Mom Por defecto Robo-Baby 2.0
17. Waka Waka Inicia con: Strange Attractor y Anti-Gravity. Mom Por defecto Death's Touch
18. The Host Inicia con: Spider Baby, The Mulligan, y The Tick como trinket. Mom Por defecto Technology .5
19. The Family Man Inicia con:Brother Bobby, Sister Maggy, Dad's Key, BFFS! y Rotten Baby.

No puedes usar lagrimas (Los familiares son la unica fuente de ataque)

Isaac Desbloqueando  Dad's Key y a 'It Lives' Epic Fetus
20. Purist No item rooms or starting items. Mom's Heart Matar al corazon de mama por primera vez Rune of Berkano

AfterbirthEditar

                                     Inicia con Isaac sin items, algo      Mom's Heart        Matar al corazon 

21. XXXXXXXXL            Parecido a Purist solo que todos                               de mama por 

                                     los Mapas son XL                                                    primera vez          Corazon de oro

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