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Los Capítulos son conjuntos de pisos que contienen diferentes enemigos, temas, jefes y dificultades. Los primeros capítulos se dividen en dos pisos, mientras que los últimos capítulos contienen un solo piso. Cada capítulo tiene también su propia música.

Capítulo 1Editar

Basement-0 Cellar Burning Basement
Basement Cellar (Afterbirth) Burning Basement

Capítulo 2Editar

Caves-0 Catacombs
The Caves The Catacombs

Capítulo 3Editar

Depths-0 Necropolis
The Depths Necropolis

Capítulo 4Editar

Womb-0 Utero
The Womb Utero

Capítulo 5Editar

Cathedral-0 Sheol-0
Cathedral Sheol

Capítulo 6Editar

The Chest-0 Dark Room
The Chest Dark Room